PRCTICA 14 ; 2º TRIMESTRE 20 de enero 2021

2º TRIMESTRE

PRACTICA 14

ESTUDIO DE LA FRAGILIDAD OSMITICA DE LOS ERITROCITOS (FOE-ROE O ROG)

• OBJETIVO

Estudiar la fragilidad de los eritrocitos, ayudándonos de un espectrofotómetro.

• FUNDAMENTO 

El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil (soluciones hipotónicas).
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis).
En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70 % como máximo.
Esta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE). Dentro de una misma sangre, la ROE de los hematíes varía de unos a otros. 

• MATERIAL Y REACTIVOS 

 Pipetas Pasteur
Tubos de centrífuga iguales
  Un reloj 
 Una centrífuga
Un espectrofotómetro
 Cubetas de espectrofotómetro 
 Una gradilla.
Suero fisiológico
Muestra de sangre 

Cloruro sódico  

• DESARROLLO 

1. Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones decrecientes, de la forma que se indica en la siguiente tabla: 

Tubo nº	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
Agua destilada  (gotas/ml)	0	1 50	2 100	3 …	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
Suero fisiológico  tamponado (gotas//ml)	18 900 ml	17 850	16 800	15 750	14 700	13 650	12 600	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
Concentración obtenida (g/L)	9	8,5	8	7,5	7	6,5	6	5,5	5	4,5	4	3,5	3	2,5	2	1,5	1	0,5

2. Añadir a cada tubo 50 ul de sangre completa.  

3. Agitar suavemente el tubo. 

4. Dejar los tubos a reposo unos 30 minutos, a temperatura ambiente. 

5. Centrifugamos a 2000 rpm 5 minutos para que sedimenten o los dejamos en reposo unas 3 horas. 

• CALCULOS Y RESULTADOS

 A mi me toco hacer las concentraciones con los números pares, y usamos una doble cantidad de todo.

 La lectura de resultados puede ser visual o espectrofotométrica. En ambos casos, lo que se valora es la presencia o la ausencia de hemólisis en los tubos. 

Si la lectura es visual, se considera que no hay hemólisis cuando en el tubo se observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Sin embargo, se estima que hay una hemólisis parcial cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, que se acompaña de un sobrenadante rojizo y transparente. Y, finalmente, se considera que la hemólisis es total cuando sólo se aprecia la existencia de un líquido rojizo y transparente, sin ningún botón sedimentario.

Si los eritrocitos presentes en el botón sedimentario de cualquier tubo se resuspenden mediante agitación, el sobrenadante se enturbiará.

Para realizar la lectura espectrofotométrica, se recoge el líquido sobrenadante, sin resuspender, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos, en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda (λ) de 540 nm.

Como blanco para la lectura espectrofotométrica se utiliza el líquido presente en el tubo nº 1, ya que al haber sido elaborado a partir de una solución de cloruro sódico a una concentración de 9 g/L, se supone que la hemólisis debe ser nula y, por tanto, que la absorbancia medida en él será cero.

Los resultados de cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje (%) de hemólisis. Para ello se considera que la absorbancia medida en el líquido procedente del tubo nº 18 corresponde a un 100 % de hemólisis, ya que al haber sido preparado con la solución más hipotónica, será el más hemolizado. Por tanto, el porcentaje de hemólisis que corresponde a cada tubo se calcula con la siguiente fórmula:

                    A
% de hemólisis = ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ x 100
                     A_M

A = Absorbancia del líquido presente en el tubo analizado.
A_M =Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 18 (Absorbancia máxima).
 

Los resultados de la absorbancia es:  
 2= 0,066 A
4= 0,087 A
6= 0,103  A
 8= 0,529 A
10= 2,756 A
12= 2,684 A
14= 2,774 A
16= 2,847 A
18= 2,737 A

Su porcentaje de hemolisis es: 
2= 2,411%
4= 3,17%
6= 3,76%
8= 19,32%
10= 100,69%
12= 98,06%
14= 101,35%
16= 104,01%
18= 100%